Идентификация вариации числа копий CAPN10 у тайцев с диабетом 2 типа с помощью мультиплексной ПЦР и денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( DHPLC ).
Было показано, что вариации числа копий (CNV) связаны с несколькими заболеваниями. Они могут вызывать отклонение генотипов от равновесия Харди-Вайнберга (HWE) . Исследования ассоциации генетический случай-контроль в Тайланде показали, что распределение генотипов CAPN10 Indel19 отклонялось от HWE после исправления ошибки генотипирования. Таким образом, мы стремимся идентифицировать CNV в области CAPN10 Indel19.
Метод полуколичественной денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) был использован для обнаружения CNV в области маркера CAPN10 Indel19 в когорте 305 пациентов с диабетом 2 типа и 250 контрольных субъектов без диабета. CNVs в области CAPN10 Indel19 был успешно обнаружен с помощью DHPLC .
После корректировки определения генотипа на основе статуса идентифицированных CNV, генотипы CAPN10 Indel19 были хорошо приспособлены для HWE (p> 0,05) . Однако мы не обнаружили связи между генотипами CNV и риском диабета 2 типа в нашей популяции. CNV в CAPN10 были идентифицированы у тайцев. Эти CNVs приводят к отклонению от HWE генотипов CAPN10 Indel19 . После исключения идентифицированных CNV из анализа, CAPN10 Indel19 был связан с диабетом 2 типа. Информация, полученная в результате нашего исследования, может быть полезна для точности генотипирования SNP, находящихся в области CNV .
Нуклеаза DHPLC / SURVEYOR: чувствительный, быстрый и доступный метод анализа мутаций BRCA1 и BRCA2 в семьях рака груди.
Наследственный рак молочной железы составляет около 10% всех случаев рака молочной железы, и гены BRCA1 и BRCA2 были идентифицированы как проверенные гены предрасположенности к этой патологии. Тестирование на мутации гена BRCA обычно основано на подходе предварительного скрининга, таком как метод частичной денатурации DHPLC и прямое капиллярное секвенирование.
Однако этот подход требует много времени из-за большого размера генов BRCA1 и BRCA2. Недавно был разработан новый недорогой и экономящий время протокол DHPLC для анализа генных мутаций с использованием расщепления нуклеазой SURVEYOR® и анализа DHPLC . Подгруппа из 90 пациентов, включенных в Программу генетического консультирования Национального онкологического центра Бари (Италия), была проведена для проверки этого подхода.
Предыдущий ретроспективный анализ показал, что 9/90 пациентов (10%) были мутированы в генах BRCA1 и BRCA2, и эти данные были подтверждены настоящим подходом. Образцы ДНК были подвергнуты Landing PCR и, впоследствии, расщеплению нуклеазой SURVEYOR (®). Ампликоны BRCA1 и BRCA2 были разделены на группы в зависимости от размера ампликона, чтобы обеспечить переваривание нескольких ампликонов.
Продукт этой реакции анализировали на системе анализа высокочувствительных фрагментов трансгеномной нуклеиновой кислоты WAVE . Оператор, выполнявший метод обследования DHPLC, в то время не знал результатов секвенирования. СЮРВЕЙЕРСКИЙ (®) нуклеаза DHPLC подход был способен обнаружить все изменения с чувствительностью 95%. Кроме того, чтобы сэкономить время и реагенты, был утвержден препарат для настройки мультиампликона.
Description: A competitive ELISA for quantitative measurement of Human Myosin 1(MYH1) in samples from blood, plasma, serum, cell culture supernatant and other biological fluids. This is a high quality ELISA kit developped for optimal performance with samples from the particular species.
Description: A competitive ELISA for quantitative measurement of Human Myosin 1(MYH1) in samples from blood, plasma, serum, cell culture supernatant and other biological fluids. This is a high quality ELISA kit developped for optimal performance with samples from the particular species.
Description: A competitive ELISA for quantitative measurement of Human Myosin 1(MYH1) in samples from blood, plasma, serum, cell culture supernatant and other biological fluids. This is a high quality ELISA kit developped for optimal performance with samples from the particular species.
Высокоэффективная жидкостная хроматография в частично денатурирующих условиях ( dHPLC ) — это быстрый и экономичный метод скрининга молекулярных дефектов: четыре новые мутации, обнаруженные при Х-сцепленной хронической гранулематозной болезни.
Внедрение точных методов в рутинной диагностике хронической гранулематозной болезни (ХГБ), которые ускоряют скрининг молекулярных дефектов, может иметь решающее значение для быстрого предположения прогноза пациента. В этом исследовании сравнивалась эффективность анализа однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP) и высокоэффективной жидкостной хроматографии в частично денатурирующих условиях (dHPLC) для скрининга мутаций у пациентов с CGD. Мы отобрали 10 пациентов мужского пола с ХГБ, в анамнезе которых были тяжелые рецидивирующие инфекции и нарушение функции респираторного взрыва. Образцы гДНК, мРНК и кДНК получали стандартными методами. Экзоны CYBB амплифицировали с помощью ПЦР и проверяли с помощью SSCP или dHPLC. Аномальные фрагменты ДНК секвенировали, чтобы выявить природу мутаций.
Методы SSCP и dHPLC показали аномалии ДНК соответственно в 55% и 100% случаев. Секвенирование образцов аномальной ДНК подтвердило мутации во всех случаях. Были идентифицированы четыре новые мутации в CYBB, которые были обнаружены только при скрининге dHPLC (c.904 insC, c.141 + 5 g> t, c.553 T> C и c.665 A> T) . Эта работа подчеркивает актуальность dHPLC, чувствительного, быстрого, надежного и экономичного метода скрининга мутаций при CGD, который в сочетании с функциональными анализами, оценивающими респираторный взрыв фагоцитов, будет способствовать ускорению окончательной диагностики X-сцепленного CGD, непосредственно лечение, генетическое консультирование и четкое предположение о прогнозе. Эта стратегия особенно подходит для развивающихся стран.
Использование DHPLC (денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография) при скрининге II уровня гена CFTR в пренатальной диагностике.
ЦЕЛЬ
Цель исследования — оценить роль денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) во втором уровне скрининга гена регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR).
МЕТОДЫ
9-месячное проспективное исследование, проведенное в период с июня 2008 г. по март 2009 г. в Медицинском центре Artemisia Fetal Medical Heart, включало 3829 образцов околоплодных вод у женщин, перенесших амниоцентез в середине триместра. Генетический диагноз CF был основан на исследовании основных мутаций CFTR. ген на ДНК плода, выделенный из амниоцитов (скрининг первого уровня) с использованием различных коммерческих диагностических систем. Скрининг второго уровня с использованием DHPLC на амниотической жидкости и образце крови пары был предложен в случае гетерозиготных на первом уровне плода.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Из 3829 плодов 134 оказались положительными, 129 — гетерозиготными и 5 — пораженными . Из 129 пар после соответствующего генетического консультирования 53 запросили скрининг второго уровня. При использовании DHPLC 44 пары оказались отрицательными, а в девяти парах были идентифицированы девять редких мутаций.
ВЫВОДЫ
Скрининг первого уровня может быть полезен для выявления до 75% мутаций МВ . Скрининг второго уровня позволяет выявить еще 10% мутантных аллелей. Было обнаружено, что DHPLC является надежным и специфическим методом быстрой идентификации редких мутаций CFTR, которые не были обнаружены при первоначальном скрининге первого уровня.
Эффективность dHPLC для полуавтоматического анализа кДНК-AFLP и сбора фрагментов в модели гена устойчивости к парше яблони.
Анализ кДНК-AFLP для профилирования транскриптов был успешно применен для изучения многих биологических систем растений, особенно взаимодействий между растениями и микробами. Однако, как сообщается , разделение фрагментов кДНК-AFLP с помощью гель-электрофореза является трудоемким с ограниченным потенциалом автоматизации, а сбор дифференциальных полос для идентификации генов является еще более трудоемким.
В этой работе мы представляем использование dHPLC (денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография) и автоматизированный сбор фрагментов ДНК с использованием системы WAVE (®) для анализа и восстановления фрагментов кДНК-AFLP .
Этот метод успешно применяется к взаимодействию Malus-Venturia inaequalis , что позволяет собрать 66 различных фрагментов, полученных из транскриптов для генов яблока, предположительно участвующих в защитной реакции, активируемой геном устойчивости к HcrVf2.
Результаты, подтвержденные количественной ОТ-ПЦР в реальном времени, согласуются с исследуемым взаимодействием растения и патогена, и это дополнительно подтверждает пригодность dHPLC для профилирования транскриптов кДНК-AFLP . Обсуждаются особенности и преимущества этого нового подхода, демонстрирующие, что это почти полностью автоматизируемое и экономичное решение для обработки большого количества образцов и сбора дифференциальных генов, участвующих в других биологических процессах и немодельных растений.
