Использование ПЦР-DHPLC с детектированием флуоресценции для характеристики бактериального разнообразия во время ферментации маниоки (Manihot esculenta Crantz).
Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC) была описана как подходящий метод для изучения полиморфизма ДНК. Здесь ферментационный раствор маниоки (Manihot esculenta Crantz) был исследован с использованием анализа DHPLC для характеристики бактериального разнообразия во время процесса ферментации.
GC-зажатые ампликоны, соответствующие вариабельной области рДНК 16S бактериального сообщества, были синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), а затем разделены на основе состава оснований с использованием препаративной DHPLC.
Фракции элюата собирали случайным образом и использовали в качестве источника ДНК всего сообщества, которую можно было использовать для определения бактериального разнообразия. В качестве первого подхода GC-зажимы удаляли из элюированных фрагментов ДНК с помощью ПЦР, чтобы избежать возможного смещения, которое эти зажимы могли вызвать во время конструирования библиотек клонов. В качестве второго подхода была создана библиотека клонов каждого образца элюата, сохраняющая GC-зажимы фрагментов ДНК .
Первый подход генерировал 132 бактериальные последовательности рДНК со средним размером 200 п.н., 45% из которых имели сходство с некультивируемыми или неклассифицированными бактериями. Второй подход дал 194 последовательности, идентифицированные как Proteobacteria (48%), некультивируемые или неклассифицированные экологические бактерии (40%) и Firmicutes (12%).
Мы обнаружили значительно большее разнообразие бактерий, используя первый подход, чем второй подход. Метод DHPLC-PCR позволил быстро и без труда обнаружить огромное разнообразие бактерий, которое было связано с ферментацией маниоки, и мы пришли к выводу, что это многообещающая альтернатива для характеристики общего микробного разнообразия в сложных образцах.
Использование COLD-PCR, DHPLC и GeneScanning для высокочувствительного обнаружения соматических мутаций c-KIT в опухолях тучных клеток собак.
Обычные методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) / секвенирования могут плохо подходить для обнаружения соматических мутаций в образцах тучных клеток собак (МСТ) из-за ограниченной чувствительности. Это исследование было направлено на создание новых и более чувствительных методов, оценку их предела обнаружения и сравнение их чувствительности с традиционными методами.
Две различные «драйверные» соматические мутации c-KIT, вместе с аналогами дикого типа, были клонированы в плазмидах для получения стандартных образцов с известными концентрациями мутировавших аллелей на фоне аллелей дикого типа ; стандарты плазмид анализировали с использованием обычного или нового высокочувствительного метода.
Обычная ПЦР / секвенирование показала чувствительность 50-20%. И наоборот, все новые методы, получившие более высокую чувствительность, позволили достичь всего 2,5-1,2% мутированной ДНК . Исследование демонстрирует, что ранние традиционные методы, вероятно, могли недооценивать распространенность KIT-мутаций MCT, что влияло на оценку их значимости в прогноз и эффективность лечения ингибитором тирозинкиназы (ИТТ).
Эффективное обнаружение мутации гена IDUA с комбинированным использованием dHPLC и образцов сухой крови
Цели . Разработка простого метода, направленного на мутации, позволяющего снизить стоимость тестирования на мутации с использованием легко доступного биологического материала. Оценка возможности использования такого метода была проверена с использованием GC-богатого ампликона. Дизайн и методы . Метод денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (dHPLC) был усовершенствован и реализован как метод обнаружения вариантов в экзоне 9 гена IDUA . Оптимизированный метод был протестирован на 500 образцах геномной ДНК, полученных из сухих пятен крови (DBS).
Полученные результаты. С помощью этого подхода dHPLC можно было обнаружить различные варианты, включая распространенную мутацию p.Trp402Ter в гене IDUA. Высокое содержание GC не повлияло на разрешение и надежность этого метода, а также было достигнуто различение трансверсий GC. Заключение. Доказано, что этот метод dHPLC на основе ПЦР является быстрым , чувствительным и отличным вариантом для скрининга многочисленных образцов, полученных из DBS. Более того, это привело к последовательному обнаружению четко различимых профилей общего p. Мутация Trp402Ter IDUA с выгодным соотношением стоимости и технических требований.
Description: This is Double-antibody Sandwich Chemiluminescent immunoassay for detection of Human Filaggrin (FLG) in Tissue homogenates and other biological fluids.
Description: This is Double-antibody Sandwich Chemiluminescent immunoassay for detection of Human Filaggrin (FLG) in Tissue homogenates and other biological fluids.
Description: This is Double-antibody Sandwich Chemiluminescent immunoassay for detection of Human Filaggrin (FLG) in Tissue homogenates and other biological fluids.
Description: This is Double-antibody Sandwich Chemiluminescent immunoassay for detection of Human Filaggrin (FLG) in Tissue homogenates and other biological fluids.
Description: Double-antibody Sandwich chemiluminescent immunoassay for detection of Human Filaggrin (FLG)Tissue homogenates and other biological fluids
Description: A sandwich quantitative ELISA assay kit for detection of Human Filaggrin (FLG) in samples from tissue homogenates, cell lysates, cell culture supernates or other biological fluids.
Description: A sandwich quantitative ELISA assay kit for detection of Human Filaggrin (FLG) in samples from tissue homogenates, cell lysates, cell culture supernates or other biological fluids.
Description: Quantitativesandwich ELISA kit for measuring Human Filaggrin (FLG) in samples from serum, plasma, tissue homogenates, cell lysates. A new trial version of the kit, which allows you to test the kit in your application at a reasonable price.
Description: Quantitativesandwich ELISA kit for measuring Human Filaggrin(FLG) in samples from serum, plasma, tissue homogenates, cell lysates. Now available in a cost efficient pack of 5 plates of 96 wells each, conveniently packed along with the other reagents in 5 separate kits.
DHPLC и MS исследования фотоиндуцированной внутрицепочечной поперечной сшивки в ДНК, меченной 5-бром-2′-дезоксиуридином.
Хорошо известно, что замена тимидина на 5-бром-2′-дезоксиуридин (BrdU) в ДНК делает ее сенсибилизированной к УФ-B свету. Облучение биополимера, замещенного таким образом, приводит к разнообразным видам повреждений ДНК, таким как внутрицепочечные сшивки, одно- и двухцепочечные разрывы или щелочно-лабильные участки, которые ранее изучались с помощью широкого спектра аналитических методов.
Здесь мы демонстрируем, что полностью денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC), недооцененная до сих пор в исследованиях повреждений ДНК, может выступать в качестве недорогого заменителя с высоким разрешением обычно применяемого гель-электрофореза.
Мы сообщаем об анализе DHPLC / масс-спектрометрии (МС) фотолитов, полученных при УФ-облучении водных растворов, содержащих 40 пар оснований длинного двухцепочечного олигонуклеотида, меченного BrdU в одной из его цепей. УФ-продукт обнаруживали с помощью ВЭЖХ при температуре 70 ° C. Последующий МС-анализ с ионизацией электроспреем (ESI-MS) фотолита , ферментативное расщепление облученного материала и анализ HPLC и MS (LC-MS) гидролизата недвусмысленно продемонстрировали, что внутрицепочечный ковалентный димер, включающий аденин и урацил, образуется в облучаемая система.
Использование денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( DHPLC ) для характеристики бактериальной и грибковой микробиоты дыхательных путей пациентов с муковисцидозом.
Целью этого исследования было оценить использование денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) для характеристики микробиоты дыхательных путей при муковисцидозе (CF), включая бактерии и грибы. Условия DHPLC были сначала оптимизированы с использованием смеси ампликонов ПЦР гена 16S рРНК областей V6, V7 и V8 от 18 видов бактерий, обычно встречающихся у пациентов с МВ.
Затем микробное разнообразие four образцов мокроты от four пациентов с МВ было проанализировано с использованием методов культивирования , клонирования / секвенирования (только для бактерий) и сбора / секвенирования пиковой фракции DHPLC . Анализ DHPLC позволил идентифицировать больше видов бактерий и грибов, чем классические методы культивирования, включая хорошо известные патогены, такие как Pseudomonas aeruginosa.
Даже если с помощью DHPLC было идентифицировано меньшее количество бактериальных операционных таксономических единиц (OTU) , это позволило найти OTU, не идентифицированные путем клонирования / секвенирования. Комбинация обоих методов позволила коррелировать большинство пиков DHPLC с определенными OTU .
Наконец, хотя обнаружение Aspergillus fumigatus с помощью DHPLC еще можно улучшить, этот метод явно позволил идентифицировать большее количество видов грибов по сравнению с классическими методами на основе культивирования. В заключение, DHPLC предоставил важные дополнительные данные о патогенных бактериях и грибах, а также о привередливых микроорганизмах, присутствующих в дыхательных путях при МВ. DHPLC можно рассматривать как дополнительный метод к культуральным анализам в обычных микробиологических лабораториях.
