Молекулярное профилирование сообществ диатомей в отложениях тропических озер


confocal-club

Систематический анализ митохондриальных генов, связанных с потерей слуха у населения Японии:  dHPLC  выявляет новую мутацию-кандидат.

ЗАДНИЙ ПЛАН

Варианты митохондриальной ДНК (мтДНК) были оценены на предмет их связи с потерей слуха. Хотя этническое происхождение влияет на спектр вариантов мтДНК, о систематическом мутационном анализе мтДНК у японских пациентов с потерей слуха не сообщалось.

МЕТОДЫ

Используя денатурирующую высокоэффективную жидкостную хроматографию в сочетании с прямым секвенированием и клонированием-секвенированием, японские пациенты с проязычной (N = 54) или постлингвальной (N = 80) сенсоневральной тугоухостью не имели патогенных мутаций m.1555A >> G и m.3243A. >> G и GJB2 подвергались мутационному анализу генов мтДНК (12S рРНК, tRNALeu (UUR), tRNASer (UCN), tRNALys, tRNAHis, tRNASer (AGY) и tRNAGlu).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы обнаружили 15 вариантов в 12S рРНК и один гомоплазматический вариант m.7501A >> G в tRNASer (UCN); в остальных генах вариантов не обнаружено . Два критерия, а именно низкая частота в контроле и высокая консервативность среди животных, выбрали варианты m.904C >> T и m.1105T >> C в 12S рРНК в качестве кандидатов на патогенные мутации. Были предсказаны изменения во вторичных структурах двух вариантов транскриптов, а также m.7501A >> G в tRNASer (UCN).

ВЫВОДЫ

Было обнаружено, что вариант m.904C >> T является новой мутацией-кандидатом, связанной с потерей слуха . Вариант m.1105T >> C вряд ли является патогенным. Патогенность гомоплазматического варианта m.7501T >> A требует дальнейшего изучения.

Молекулярное профилирование сообществ диатомей в отложениях тропических озер с использованием таксон-специфической ПЦР и денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( ПЦР-DHPLC ).

Здесь мы представляем протокол для генетического обнаружения диатомовых водорослей в отложениях тропического озера Найваша в Кении, основанный на таксон-специфической ПЦР-амплификации коротких фрагментов (примерно 100 п.н.) гена малой субъединицы рибосомы (SSU) и последующем разделении видоспецифической ПЦР. продукты денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией на основе ПЦР (DHPLC).

Оценка ампликонов, различающихся специфичностью праймеров для диатомовых водорослей и длиной амплифицированных фрагментов, показала, что количество различных типов последовательностей диатомовых водорослей, обнаруженных после клонирования продуктов ПЦР, критически зависит от специфичности праймеров для диатомовых водорослей и длины амплифицированных фрагментов, в результате чего более короткие фрагменты дали больше видов диатомовых водорослей.

DHPLC был способен различать очень короткие ампликоны на основе различия последовательностей, даже если фрагменты были одинаковой длины и если ампликоны различались только небольшим количеством нуклеотидов. Как правило, метод идентифицировал типы доминантных последовательностей из смешанных амплификаций.

Сравнение с микроскопическим анализом образцов донных отложений показало, что типы последовательностей, идентифицированные при молекулярной оценке, хорошо соответствуют наиболее доминирующим видам. Таким образом, протокол DHPLC на основе ПЦР предлагает быструю, надежную и экономичную возможность изучения ДНК из отложений и других образцов окружающей среды с неизвестным органическим содержанием даже для очень коротких фрагментов ДНК.

confocal-club
confocal-club

Разработка нового   анализа DHPLC для генотипирования полиморфизма UGT1A (TA) n, связанного с синдромом Гилберта.

ЗАДНИЙ ПЛАН

Синдром Жильбера – наиболее частое наследственное нарушение обмена билирубина. Причинная мутация у кавказцев почти полностью связана с вставкой (ТА) динуклеотида в промотор UGT1A1. Пораженные люди гомозиготны по варианту промотора и имеют 7 повторов ТА вместо 6. Промоторы с 5 и eight повторами ТА также существуют, но крайне редки у кавказцев.

Целью нашего исследования было разработать анализ денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) для генотипирования полиморфизма UGT1A1 (TA) n и сравнить его с ранее описанным анализом однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP).

МЕТОДЫ

Пятьдесят образцов ДНК с общими генотипами ((TA) 6/6, (TA) 6/7, (TA) 7/7), а также 7 образцов с одним из следующих редких генотипов – (TA) 5/6, (TA) ) 5/7, (TA) 6/eight или (TA) 7/eight амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и генотипировали с помощью DHPLC с использованием режима определения размера. Все образцы были предварительно генотипированы с помощью анализа SSCP, который был подтвержден анализом секвенирования.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Все образцы с общим или редким генотипом показали полностью совпадающие результаты между анализами DHPLC и SSCP. Наши результаты показывают, что анализ DHPLC более эффективен по сравнению с классическим анализом SSCP из-за более короткого времени анализа генотипирования, возможности генотипирования увеличенного количества образцов в день, более высокой надежности, воспроизводимости и экономической эффективности без потери точности при обнаружении все генотипы UGT1A1 (TA) n.

ВЫВОДЫ

Мы разработали новый анализ DHPLC, который подходит для точного, автоматизированного, высокопроизводительного и надежного генотипирования всех вариантов полиморфизма UGT1A1 (TA) n по сравнению с трудоемким и длительным анализом SSCP.

 

Идентификация мутаций в генах липопротеинлипазы (LPL) и аполипопротеина C-II (APOC2) с помощью денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( DHPLC ).

ЗАДНИЙ ПЛАН

Эндотелиальная липопротеинлипаза (LPL) гидролизует триглицериды хиломикронов и липопротеины очень низкой плотности, высвобождая свободные жирные кислоты для местного и системного использования. Мутации в гене LPL или его кофакторе APOC2 могут привести к снижению или полной потере функции фермента и, как следствие, к гиперлипопротеинемии I типа.

МЕТОДЫ

Мы использовали ПЦР для амплификации всех экзонов и промоторной области LPL и APOC2. Девять слепых образцов ДНК с известными мутациями LPL использовали в качестве положительного контроля. Кроме того, были проанализированы девять пациентов из нашей липидной клиники и двенадцать здоровых субъектов. ДНК подвергали скринингу на наличие вариантов последовательностей с помощью денатурирующей ВЭЖХ (DHPLC) с последующим прямым секвенированием фрагментов ПЦР, показывающих различные профили элюирования.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Все варианты последовательности LPL в положительных контролях (D9N, V69L, delAACTG386, I225T, N291S и S447X) были правильно идентифицированы. У остальных пациентов были обнаружены дополнительные варианты в LPL и APOC2. Эти варианты также присутствовали у здоровых субъектов , что указывает на то, что они представляют собой скрытую вариацию без существенного влияния на триглицериды плазмы, по крайней мере, в гетерозиготном состоянии.

ВЫВОДЫ

Полуавтоматический метод скрининга DHPLC был разработан для обнаружения вариантов последовательностей в генах LPL и APOC2. Наши результаты показывают, что метод был надежным и чувствительным.

Анализ полиморфизма промотора гена глутатион-S-трансферазы альфа-1 (hGSTA1) человека с использованием денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( DHPLC ).

ЦЕЛЬ

Фермент GST, кодируемый геном hGSTA1, катализирует GSH-зависимую детоксикацию различных канцерогенных метаболитов и алкилирующих химиотерапевтических агентов. Два генетических варианта hGSTA1 , а именно hGSTA1 * A и hGSTA1 * B, характеризуются тремя связанными SNP, из которых -52 G> A вариация, единственная ответственная за дифференциальную промоторную активность hGSTA1.

У лиц, гомозиготных по hGSTA1 * B, наблюдается низкая экспрессия hGSTA1 в печени. Учитывая трудоемкость метода ПЦР-ПДРФ и прямое предсказание вариации -52 G> A , мы решили установить высокопроизводительную процедуру DHPLC для характеристики вариантов hGSTA1.

МЕТОДЫ

В исследование были включены 117 образцов ДНК из Южной Индии. Контрольные образцы были получены для DHPLC с использованием общепринятого метода ПЦР-ПДРФ. Гетеродуплексы получали смешиванием in vitro контрольных образцов ДНК (hGSTA1 * A) со всеми образцами, которые впоследствии подвергали анализу DHPLC. Образцы анализировали на наличие гетеродуплексов по хроматографическим профилям.

ВЫВОДЫ

Из общего количества 117 образцов 43,5% являются гомозиготными по аллелю hGSTA1 * A, 13% гомозиготны по аллелю hGSTA1 * B и 43,5% являются гетерозиготами hGSTA1 * A / B. Насколько нам известно, это первый отчет об использовании DHPLC для оценки полиморфизма промотора гена hGSTA1.

Have any Question or Comment?

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *