Роман DHPLC основанное процедуру для анализа COL1A1 и COL1A2 мутаций в несовершенный остеогенез.
Примерно у 90% пациентов с несовершенным остеогенезом (НО) обнаруживаются доминантные мутации COL1A1 или COL1A2; однако молекулярный анализ затруднен, потому что эти гены охватывают 51 и 52 экзона соответственно. Мы разработали процедуру ПЦР-денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) для анализа кодирующих областей COL1A1 или COL1A2 и проверили ее, используя 130 образцов ДНК от людей без OI, 25 образцов ДНК из двух клеток, чтобы исследовать потенциал процедуры для доимплантационной диагностики. и образцы ДНК от 10 пациентов с ОИ.
Три новых интронных варианта in vitro были экспрессированы с использованием минигенного анализа для оценки их влияния на сплайсинг. Процедура быстрая, недорогая и воспроизводимая. Анализ образцов от людей без OI выявил шесть новых и несколько известных полиморфизмов, полезных для диагностики сцепления из-за высокой гетерозиготности. Анализ двухклеточных образцов подтвердил известный генотип в 24 из 25 экспериментов; ДНК не удалось амплифицировать только в одном случае. Случаев выпадения аллелей не зарегистрировано.
DHPLC выявил шесть новых мутаций, три из которых были интронными, у всех пациентов с ОИ, и эти результаты были подтверждены с помощью прямого секвенирования COL1A1 и COL1A2. Экспрессия интронных мутаций продемонстрировала, что вариант 804 + 2_804 + 3delTG в интроне 11 нарушает нормальный сплайсинг, тем самым приводя к образованию двух альтернативных продуктов. Варианты c.3046-4_3046-5dupCT (COL1A1) и c.891 + 77A> T (COL1A2) не повлияли на сплайсинг.
Описанный протокол DHPLC в сочетании с анализом минигена может способствовать молекулярной диагностике ОИ. Кроме того, этот протокол поможет в консультировании по поводу пренатальной и доимплантационной диагностики.
Валидация метода ПЦР-dHPLC для быстрой идентификации филогенетически родственных видов Candida glabrata в различных биологических матрицах.
- Поскольку были описаны два новых вида, филогенетически связанных с Candida glabrata, с немного разными фенотипами и профилями чувствительности к противогрибковым препаратам, с клинической точки зрения представляется необходимым разработать быструю и точную систему идентификации , чтобы различать эти три вида грибов.
- Мы изучили эффективность денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (dHPLC) как более быстрого (менее 7 мин) и альтернативного нового метода одновременного анализа видов Candida в различных биологических матрицах.
- Анализы показывают хороший низкий предел обнаружения (LLOD) во всех изученных биологических матрицах (5,16-9,56 нг мкл (-1), 4,14-4,70 нг мкл (-1) и 3,99-4,66 нг мкл (-1) для Candida bracarensis, Candida nivariensis и C. glabrata соответственно). Было проанализировано 180 изолятов Candida, чтобы продемонстрировать пригодность метода для скринингового анализа для идентификации C. glabrata и ее скрытых видов (C. bracarensis и C. nivariensis) в повседневной клинической практике.
Сравнение аллельной дискриминации с помощью dHPLC , HRM и TaqMan при обнаружении мутации BRAF V600E.
Мутация V600E в онкогене BRAF связана с колоректальной карциномой, с дефицитом восстановления несоответствия и, в последнее время, с отсутствием ответа на терапию ингибиторами рецепторов эпидермального фактора роста. Важно использовать надежные методы его обнаружения.
Целью нашего исследования было сравнение рабочих характеристик детекции V600E денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (dHPLC) и плавления высокого разрешения (HRM) с аллельной дискриминацией TaqMan, а также методами прямого секвенирования в серии из 195 колоректальных парафинов. -вставленные экземпляры в возрасте до 15 лет. Эффективность получения результатов о статусе мутации была лучше всего при использовании TaqMan (96,9%), за которым следовали dHPLC (93,3%), HRM (88,7%) и секвенирование (88,2%).
В целом TaqMan лучше всего подходил для анализа старых тканей, тогда как секвенирование было наименее эффективным. Гетерозиготный V600E был обнаружен в 11,6%, 9,9%, 11,6% и 9,9% тканей с использованием TaqMan, dHPLC, HRM и секвенирования соответственно. Соответствие результатов между dHPLC и TaqMan или секвенированием было отличным (κ = 0,9411 и κ = 0,8988, соответственно); для HRM соответствие было хорошим (κ = 0,7973 и κ = 0,7488, соответственно).
При использовании разведения ДНК из опухолевой ткани для анализа с помощью dHPLC и HRM требовалось минимум 10% V600E, несущего рак. dHPLC может обнаружить четыре мутации, не относящиеся к V600E, тогда как HRM обнаружил одну. Наши результаты показывают, что dHPLC и HRM — это методы, которые можно надежно использовать для обнаружения мутации BRAFV600E в архивных тканях, залитых парафином.
Комбинация стратегии на основе мультиплексной ПЦР и DHPLC для схемы генотипирования CYP2D6 у тайцев
ЦЕЛЬ
Разработать схему генотипирования CYP2D6 для точного определения аллелей и надежной оценки дозировки функциональных аллелей у тайцев.
МЕТОДЫ
Мы проанализировали количество копий CYP2D6 с помощью pentaplex PCR в сочетании с методом полуколичественной денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC). Десять общих SNP были генотипированы из продукта гена CYP2D6 с использованием удлинения одного основания (SBE) с последующим анализом DHPLC. Эта схема обнаружения сравнивалась с ПЦР в реальном времени и традиционным ПЦР-ПДРФ по рентабельности.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределение числа копий гена CYP2D6 в нашей популяции варьировалось от нуля (0,69%), единицы (7,99%), двух (60,07%), трех (28,13%) и четырех (3,13%). Наиболее часто обнаруживаемые SNP были связаны с гаплотипом CYP2D6 * 10. CYP2D6 * 36 в тандеме с CYP2D6 * 10B является основным типом перегруппировки у тайцев (18,75%).
ВЫВОДЫ
Мультиплексная ПЦР в сочетании со стратегией на основе DHPLC — удобный и надежный метод генотипирования CYP2D6, обеспечивающий достаточный охват аллелей для азиатов. Была продемонстрирована экономия как затрат, так и аналитического времени, и этот метод потенциально можно было модифицировать, чтобы приспособить генотипирование CYP2D6 к другим этническим группам.
Применение денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( DHPLC ) для идентификации рыб: новый способ определения состава обработанного корма, содержащего несколько видов.
Идентификация видов рыб в трансформированных пищевых продуктах затруднена, поскольку существующие методы не адаптированы для продуктов термической обработки, содержащих более одного вида. Используя общую для всех позвоночных область гена цитохрома b, мы разработали метод денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), позволяющий идентифицировать большинство видов в коммерческих крабовых палочках.
Целая рыба и филе были использованы для создания библиотеки референтных профилей DHPLC. Крабовые палочки генерировали сложные профили DHPLC, в которых количество содержащихся видов рыб можно оценить по количеству основных пиков флуоресценции.
Идентичность некоторых видов была предсказана путем сравнения пиков с референтными профилями, а другие были идентифицированы после сбора фракций пиков, повторной амплификации и секвенирования. DHPLC представляется быстрым и эффективным методом анализа видового состава сложных термически обработанных рыбных продуктов.