Генотипирование фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF) Полиморфизм повторов CATT₅₋₈ с помощью денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( DHPLC )
Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF) представляет собой провоспалительный цитокин, экспрессирующийся во многих различных типах клеток и участвующий в патогенезе множества острых и хронических воспалительных заболеваний. Переменное количество тандемных повторов (VNTR) CATT5-Eight в положении -794 в промоторе гена MIF было связано с несколькими патологическими состояниями человека. Описаны различные методы генотипирования тетрануклеотидных повторов CATT.
Здесь мы впервые сообщаем о полной характеристике полиморфизма повторов CATT5-Eight с использованием исключительно метода денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) в частично денатурирующих условиях.
Этот подход, основанный на пошаговом протоколе DHPLC, позволил точно определить все гомозиготные и гетерозиготные генотипы в 350 образцах ДНК от контрольных субъектов. Результаты были подтверждены сравнением с секвенированием ДНК, и подход DHPLC был точным, чувствительным и хорошо воспроизводимым.
Данные текущего исследования демонстрируют, что этот метод анализа с помощью DHPLC может представлять собой мощный и чувствительный альтернативный инструмент для быстрого и эффективного генотипирования коротких тандемных повторов, представляющих ограниченное количество аллелей.
DHPLC — это высокочувствительный и быстрый метод скрининга для выявления мутации BRAF (V600E) при папиллярной карциноме щитовидной железы.
Сообщалось, что мутация BRAF (V600E) встречается в 30–80% папиллярных карцином щитовидной железы (PTC). Хотя прямое секвенирование — это метод, наиболее часто используемый для выявления мутаций, этот метод недостаточно чувствителен для точного обнаружения мутаций низкого уровня. Чтобы определить оптимальный диагностический метод для выявления мутации BRAF (V600E) в PTC , мы сравнили диагностическую эффективность четырех репрезентативных методов обнаружения в фиксированных формалином парафиновых тканях щитовидной железы, полученных от 40 пациентов с диагнозом PTC. Чтобы обнаружить мутацию BRAF (V600E), мы амплифицировали экзон 15 гена BRAF и провели мутационный анализ с прямым секвенированием, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией (DHPLC), пиросеквенированием и колориметрическим анализом.
Мутация BRAF была обнаружена в 33 случаях (82,5%) с помощью DHPLC, в 23 случаях (57,5%) с помощью прямого секвенирования, в 22 случаях (55,0%) с помощью пиросеквенирования и в 37 случаях (92,5%) с помощью колориметрического анализа. Чувствительность, отрицательная прогностическая ценность и точность DHPLC были 100%. Специфичность и положительные прогностические значения для DHPLC, прямого секвенирования и пиросеквенирования составили 100%, а для колориметрического анализа — 14,3% и 83,8% соответственно. Значение каппа для DHPLC было идеально 1,0, что превосходило другие методы. В заключение, DHPLC — это чувствительный, специфический и точный метод обнаружения мутации BRAF (V600E), особенно мутации низкого уровня, в PTC.
confocal-club
Recombinant Human Glutaminase kidney isoform, GST, E.coli-10ug
Description: A sandwich quantitative ELISA assay kit for detection of Rat Glutaminase (GLS) in samples from serum, plasma, tissue homogenates or other biological fluids.
Description: A sandwich quantitative ELISA assay kit for detection of Rat Glutaminase (GLS) in samples from serum, plasma, tissue homogenates or other biological fluids.
Description: This is Double-antibody Sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Rat Glutaminase (GLS) in serum, plasma, tissue homogenates and other biological fluids.
Description: This is Double-antibody Sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Rat Glutaminase (GLS) in serum, plasma, tissue homogenates and other biological fluids.
Description: This is Double-antibody Sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Rat Glutaminase (GLS) in serum, plasma, tissue homogenates and other biological fluids.
Description: This is Double-antibody Sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Rat Glutaminase (GLS) in serum, plasma, tissue homogenates and other biological fluids.
Description: Enzyme-linked immunosorbent assay based on the Double-antibody Sandwich method for detection of Rat Glutaminase (GLS) in samples from serum, plasma, tissue homogenates and other biological fluids with no significant corss-reactivity with analogues from other species.
Description: This gene encodes the K-type mitochondrial glutaminase. The encoded protein is an phosphate-activated amidohydrolase that catalyzes the hydrolysis of glutamine to glutamate and ammonia. This protein is primarily expressed in the brain and kidney plays an essential role in generating energy for metabolism, synthesizing the brain neurotransmitter glutamate and maintaining acid-base balance in the kidney. Alternate splicing results in multiple transcript variants.
Description: This gene encodes the K-type mitochondrial glutaminase. The encoded protein is an phosphate-activated amidohydrolase that catalyzes the hydrolysis of glutamine to glutamate and ammonia. This protein is primarily expressed in the brain and kidney plays an essential role in generating energy for metabolism, synthesizing the brain neurotransmitter glutamate and maintaining acid-base balance in the kidney. Alternate splicing results in multiple transcript variants.
Description: GLSA1 E.Coli Recombinant fused with a 20 amino acid His tag at N-terminus produced in E.Coli is a single, non-glycosylated, polypeptide chain containing 330 amino acids (1-310a.a.) and having a molecular mass of 35.0kDa. ;The GLSA1 is purified by proprietary chromatographic techniques.
Description: A sandwich ELISA kit for detection of Glutaminase from Rat in samples from blood, serum, plasma, cell culture fluid and other biological fluids.
Применение DHPLC- скрининга гена TGFBR-Three у китаянок с идиопатической преждевременной недостаточностью яичников
ЦЕЛЬ
Оценить клиническую ценность денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), используемой для выявления полиморфизма 11 и 12 экзонов трансформирующего фактора роста бета-рецептора 3 (TGFBR-3) у женщин с идиопатической преждевременной недостаточностью яичников (POF) .
МЕТОДЫ
С февраля 2009 года по декабрь 2011 года 110 пациентов с идиопатической ПНЯ, проходивших лечение в Шэньчжэньском институте здоровья матери и ребенка при Южном медицинском университете, были включены в это исследование в качестве группы ПНЯ . Между тем, контрольную группу составили 110 женщин до 40 лет с нормальным гормональным уровнем и менструальным циклом. В экзоны 11 и 12 TGFBR-3 полиморфизма гена подвергали скринингу с помощью DHPLC, и результаты секвенирования ДНК был золотым стандартом. Были рассчитаны некоторые связанные индексы, такие как чувствительность, специфичность, ложноотрицательное значение, ложноположительное значение, индекс Юдена, положительный прогноз.значение и отрицательное прогностическое значение. В то же время 20% протестированных образцов были выбраны случайным образом и снова обнаружены методом DHPLC. Значение индекса Каппа рассчитывали путем сравнения результатов первого и второго анализа DHPLC.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
В экзоне 11 TGFBR-Three не было идентифицировано полиморфизм гена, и в экзоне 12 были идентифицированы два нуклеотидных полиморфизма. Для полиморфизма 2022 T / C частоты CC с 0,9% (1/110), TC с 22,7% (25/110). ), TT с 76,4% (84/110), C с 12,3% (27/220) и T с 87,7% (193/220) в группе POF значительно отличались от CC с 0, TC с 9,1% (10/110 ) и TT с 90,9% (100/110), C с 4,5% (10/220) и T с 95,5% (210/220) в контрольной группе (все P <0,05).
Частоты аллелей и генотипов 2161-75 C / T существенно не различались между двумя группами (все P> 0,05). В качестве золотого стандарта секвенирование ДНК показало, что DHPLC показал, что чувствительность составила 100%, специфичность — 97,9%, индекс Юдена — 97,9%, прогностическая ценность положительного результата — 96,3%, прогностическая ценность отрицательного результата — 100%, а индекс Каппа — 0,888 (P <0,05). ).
ВЫВОДЫ
Анализ DHPLC — это более надежный, надежный и практичный метод выявления полиморфизма TGFBR-3 при идиопатической преждевременной недостаточности яичников.
Фрагмент последовательности ДНК, содержащий мутацию от C до A, как удобный стандарт мутации для анализа DHPLC .
ЦЕЛЬ
Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC) — это высокопроизводительный подход для скрининга вариаций последовательности ДНК. Для оценки калибровки печи, производительности картриджа, состава и стабильности буфера используются стандарты мутации низкого и высокого диапазона WAVE для обеспечения воспроизводимости и точности хроматографического анализа. Целью этого исследования было предоставить экономичный самодельный стандарт мутаций для анализа DHPLC .
МЕТОДЫ
DHPLC выполняли для оценки различных температур элюирования фрагмента ДНК размером 374 п.н. с мутацией C> A в положении 59 для достижения профиля пика, аналогичного стандарту с низким уровнем мутаций. Чтобы проверить воспроизводимость домашнего стандарта мутации с использованием DHPLC , было проведено 15 различных экспериментов для сравнения домашнего стандарта мутации, стандарт мутации низкого диапазона WAVE с положительным контрольным образцом ДНК.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Мы определили сравнимую температуру элюирования и профиль пика со стандартом WAVE Low Vary Mutation Customary.
ВЫВОДЫ
Это исследование подтвердило воспроизводимость профиля пика нашего домашнего стандарта мутаций по сравнению со стандартом с низким уровнем мутаций с использованием анализа DHPLC .
Синдром Аладжиля: новая недостоверная мутация, обнаруженная с помощью секвенирования всего экзома в случае, ранее признанном отрицательным с помощью DHPLC и MLPA .
Синдром Алажиля (ALGS, MIM 118450) — аутосомно-доминантное мультисистемное заболевание с высокой вариабельностью. Описаны два гена: JAG1 и NOTCH2. Распространенность среди населения составляет 1:70 000 в зависимости от наличия у новорожденных заболеваний печени. Большинство случаев ( ~ 97 %) вызвано гаплонедостаточностью гена JAG1 на 20p11.2p12 , либо из-за мутаций или делеций в локусе. Менее 1% случаев вызваны мутациями в NOTCH2 .
Наиболее широко используемые методы мутационного скрининга включают денатурирующую высокоэффективную жидкостную хроматографию (DHPLC) и мультиплексную амплификацию зонда, зависимую от лигирования (MLPA) . Совсем недавно секвенирование всего экзома (WES) стало технически возможным благодаря недавним достижениям в технологиях секвенирования следующего поколения, что открывает новые возможности для идентификации мутаций / генов. Пробанд и его семейство, отрицательные на наличие мутаций в генах JAG1 и NOTCH2 ни DHPLC, ни MLPA, были проанализированы с помощью WES . Была идентифицирована миссенс-мутация, ранее не описанная, в гене JAG1. Этот результат показывает улучшение частоты обнаружения мутаций благодаря новой технологии секвенирования, что указывает на острую необходимость повторного анализа всех отрицательных случаев.
