Молекулярное профилирование сообществ диатомей в отложениях тропических озер


confocal-club

Систематический анализ митохондриальных генов, связанных с потерей слуха у населения Японии:  dHPLC  выявляет новую мутацию-кандидат.

ЗАДНИЙ ПЛАН

Варианты митохондриальной ДНК (мтДНК) были оценены на предмет их связи с потерей слуха. Хотя этническое происхождение влияет на спектр вариантов мтДНК, о систематическом мутационном анализе мтДНК у японских пациентов с потерей слуха не сообщалось.

МЕТОДЫ

Используя денатурирующую высокоэффективную жидкостную хроматографию в сочетании с прямым секвенированием и клонированием-секвенированием, японские пациенты с проязычной (N = 54) или постлингвальной (N = 80) сенсоневральной тугоухостью не имели патогенных мутаций m.1555A >> G и m.3243A. >> G и GJB2 подвергались мутационному анализу генов мтДНК (12S рРНК, tRNALeu (UUR), tRNASer (UCN), tRNALys, tRNAHis, tRNASer (AGY) и tRNAGlu).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы обнаружили 15 вариантов в 12S рРНК и один гомоплазматический вариант m.7501A >> G в tRNASer (UCN); в остальных генах вариантов не обнаружено . Два критерия, а именно низкая частота в контроле и высокая консервативность среди животных, выбрали варианты m.904C >> T и m.1105T >> C в 12S рРНК в качестве кандидатов на патогенные мутации. Были предсказаны изменения во вторичных структурах двух вариантов транскриптов, а также m.7501A >> G в tRNASer (UCN).

ВЫВОДЫ

Было обнаружено, что вариант m.904C >> T является новой мутацией-кандидатом, связанной с потерей слуха . Вариант m.1105T >> C вряд ли является патогенным. Патогенность гомоплазматического варианта m.7501T >> A требует дальнейшего изучения.

Молекулярное профилирование сообществ диатомей в отложениях тропических озер с использованием таксон-специфической ПЦР и денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( ПЦР-DHPLC ).

Здесь мы представляем протокол для генетического обнаружения диатомовых водорослей в отложениях тропического озера Найваша в Кении, основанный на таксон-специфической ПЦР-амплификации коротких фрагментов (примерно 100 п.н.) гена малой субъединицы рибосомы (SSU) и последующем разделении видоспецифической ПЦР. продукты денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией на основе ПЦР (DHPLC).

Оценка ампликонов, различающихся специфичностью праймеров для диатомовых водорослей и длиной амплифицированных фрагментов, показала, что количество различных типов последовательностей диатомовых водорослей, обнаруженных после клонирования продуктов ПЦР, критически зависит от специфичности праймеров для диатомовых водорослей и длины амплифицированных фрагментов, в результате чего более короткие фрагменты дали больше видов диатомовых водорослей.

DHPLC был способен различать очень короткие ампликоны на основе различия последовательностей, даже если фрагменты были одинаковой длины и если ампликоны различались только небольшим количеством нуклеотидов. Как правило, метод идентифицировал типы доминантных последовательностей из смешанных амплификаций.

Сравнение с микроскопическим анализом образцов донных отложений показало, что типы последовательностей, идентифицированные при молекулярной оценке, хорошо соответствуют наиболее доминирующим видам. Таким образом, протокол DHPLC на основе ПЦР предлагает быструю, надежную и экономичную возможность изучения ДНК из отложений и других образцов окружающей среды с неизвестным органическим содержанием даже для очень коротких фрагментов ДНК.

confocal-club
confocal-club

Разработка нового   анализа DHPLC для генотипирования полиморфизма UGT1A (TA) n, связанного с синдромом Гилберта.

ЗАДНИЙ ПЛАН

Синдром Жильбера — наиболее частое наследственное нарушение обмена билирубина. Причинная мутация у кавказцев почти полностью связана с вставкой (ТА) динуклеотида в промотор UGT1A1. Пораженные люди гомозиготны по варианту промотора и имеют 7 повторов ТА вместо 6. Промоторы с 5 и eight повторами ТА также существуют, но крайне редки у кавказцев.

Целью нашего исследования было разработать анализ денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) для генотипирования полиморфизма UGT1A1 (TA) n и сравнить его с ранее описанным анализом однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP).

МЕТОДЫ

Пятьдесят образцов ДНК с общими генотипами ((TA) 6/6, (TA) 6/7, (TA) 7/7), а также 7 образцов с одним из следующих редких генотипов — (TA) 5/6, (TA) ) 5/7, (TA) 6/eight или (TA) 7/eight амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и генотипировали с помощью DHPLC с использованием режима определения размера. Все образцы были предварительно генотипированы с помощью анализа SSCP, который был подтвержден анализом секвенирования.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Все образцы с общим или редким генотипом показали полностью совпадающие результаты между анализами DHPLC и SSCP. Наши результаты показывают, что анализ DHPLC более эффективен по сравнению с классическим анализом SSCP из-за более короткого времени анализа генотипирования, возможности генотипирования увеличенного количества образцов в день, более высокой надежности, воспроизводимости и экономической эффективности без потери точности при обнаружении все генотипы UGT1A1 (TA) n.

ВЫВОДЫ

Мы разработали новый анализ DHPLC, который подходит для точного, автоматизированного, высокопроизводительного и надежного генотипирования всех вариантов полиморфизма UGT1A1 (TA) n по сравнению с трудоемким и длительным анализом SSCP.

 

Идентификация мутаций в генах липопротеинлипазы (LPL) и аполипопротеина C-II (APOC2) с помощью денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( DHPLC ).

ЗАДНИЙ ПЛАН

Эндотелиальная липопротеинлипаза (LPL) гидролизует триглицериды хиломикронов и липопротеины очень низкой плотности, высвобождая свободные жирные кислоты для местного и системного использования. Мутации в гене LPL или его кофакторе APOC2 могут привести к снижению или полной потере функции фермента и, как следствие, к гиперлипопротеинемии I типа.

МЕТОДЫ

Мы использовали ПЦР для амплификации всех экзонов и промоторной области LPL и APOC2. Девять слепых образцов ДНК с известными мутациями LPL использовали в качестве положительного контроля. Кроме того, были проанализированы девять пациентов из нашей липидной клиники и двенадцать здоровых субъектов. ДНК подвергали скринингу на наличие вариантов последовательностей с помощью денатурирующей ВЭЖХ (DHPLC) с последующим прямым секвенированием фрагментов ПЦР, показывающих различные профили элюирования.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Все варианты последовательности LPL в положительных контролях (D9N, V69L, delAACTG386, I225T, N291S и S447X) были правильно идентифицированы. У остальных пациентов были обнаружены дополнительные варианты в LPL и APOC2. Эти варианты также присутствовали у здоровых субъектов , что указывает на то, что они представляют собой скрытую вариацию без существенного влияния на триглицериды плазмы, по крайней мере, в гетерозиготном состоянии.

ВЫВОДЫ

Полуавтоматический метод скрининга DHPLC был разработан для обнаружения вариантов последовательностей в генах LPL и APOC2. Наши результаты показывают, что метод был надежным и чувствительным.

Анализ полиморфизма промотора гена глутатион-S-трансферазы альфа-1 (hGSTA1) человека с использованием денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии ( DHPLC ).

ЦЕЛЬ

Фермент GST, кодируемый геном hGSTA1, катализирует GSH-зависимую детоксикацию различных канцерогенных метаболитов и алкилирующих химиотерапевтических агентов. Два генетических варианта hGSTA1 , а именно hGSTA1 * A и hGSTA1 * B, характеризуются тремя связанными SNP, из которых -52 G> A вариация, единственная ответственная за дифференциальную промоторную активность hGSTA1.

У лиц, гомозиготных по hGSTA1 * B, наблюдается низкая экспрессия hGSTA1 в печени. Учитывая трудоемкость метода ПЦР-ПДРФ и прямое предсказание вариации -52 G> A , мы решили установить высокопроизводительную процедуру DHPLC для характеристики вариантов hGSTA1.

МЕТОДЫ

В исследование были включены 117 образцов ДНК из Южной Индии. Контрольные образцы были получены для DHPLC с использованием общепринятого метода ПЦР-ПДРФ. Гетеродуплексы получали смешиванием in vitro контрольных образцов ДНК (hGSTA1 * A) со всеми образцами, которые впоследствии подвергали анализу DHPLC. Образцы анализировали на наличие гетеродуплексов по хроматографическим профилям.

ВЫВОДЫ

Из общего количества 117 образцов 43,5% являются гомозиготными по аллелю hGSTA1 * A, 13% гомозиготны по аллелю hGSTA1 * B и 43,5% являются гетерозиготами hGSTA1 * A / B. Насколько нам известно, это первый отчет об использовании DHPLC для оценки полиморфизма промотора гена hGSTA1.

Have any Question or Comment?

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *